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hellobio ICC 問題故障排除

更新時間：2024-02-26 點擊次數(shù)：827

免疫細胞化學(xué)是一個漫長的多步驟過程，需要考慮許多不同的因素。在某些時候，不可避免地會出現(xiàn)問題或不是最佳狀態(tài)。以下匯總了一些可能導(dǎo)致免疫細胞化學(xué)不起作用的最常見陷阱。

問題	潛在原因	建議的解決方案
染色弱或缺失	細胞已從蓋玻片上脫落	- 洗滌時更加輕柔或減少洗滌次數(shù)
	細胞通透性較差	- 嘗試增加 Triton X-100 的濃度
	細胞干涸	- 確保在整個實驗過程中細胞始終被過量的液體覆蓋
	細胞過度固定	- 減少細胞與固定劑一起孵育的時間
	一抗太少	- 增加一抗?jié)舛?/span> - 增加孵育時間 - 考慮采用三步檢測系統(tǒng)（例如基于生物素-鏈霉親和素）
	光照	- 確保應(yīng)用二抗后樣品永遠不會暴露在光線下 - 成像時盡可能使用最小曝光量并小心漂白（尤其是使用共焦顯微鏡）
	二抗錯誤	- 確保二抗對一抗的培養(yǎng)物種具有特異性
	靶細胞中不存在蛋白質(zhì)	- 檢查文獻以了解細胞群中是否預(yù)期存在蛋白質(zhì) - 考慮使用陽性對照
	表位因固定而被遮蓋	- 嘗試不同的固定劑 - 嘗試添加抗原修復(fù)步驟
	曝光時間太短	- 增加成像時的曝光時間和/或增益
高背景	非特異性結(jié)合	嘗試在沒有一抗的情況下測試二抗，以確保二抗不會與細胞內(nèi)的靶標(biāo)結(jié)合
	阻擋不良	- 嘗試更換封閉液 - 嘗試增加封閉孵育時間
	抗體濃度過高	- 嘗試降低一抗?jié)舛?/span> - 嘗試降低二抗?jié)舛?/span>
	反應(yīng)性醛基	- 考慮在 PBS 孵育步驟中引入 1% NaBH4
	光譜重疊	- 確保二抗的吸收/發(fā)射光譜不重疊
	洗滌不足	- 增加二次孵育后的洗滌步驟
非特異性染色	抗體與其他蛋白質(zhì)中存在的表位結(jié)合	- 嘗試不同的抗體，看看染色模式是否相關(guān)。
	抗體濃度過高	- 嘗試降低一抗和二抗?jié)舛?/span>
	與內(nèi)源性 IgG 的反應(yīng)性	- 嘗試使用在細胞來源以外的物種中產(chǎn)生的抗體（尤其是在原代細胞培養(yǎng)物中）

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