花青染料是在兩個帶有離域電荷的氮原子之間含有聚次甲基橋的分子：

由于其結(jié)構(gòu)，花青具有很高的消光系數(shù)，通常超過 100,000 Lmol -1 cm -1。不同的取代基可以控制發(fā)色團(tuán)的特性，例如吸光度波長、光穩(wěn)定性和熒光。例如，吸光度和熒光波長可以通過選擇聚次甲基橋長度來控制：較長的花青具有較高的吸光度和發(fā)射波長，直至近紅外區(qū)域。

許多花青染料已用于生命科學(xué)應(yīng)用。一系列噻唑和惡唑染料已被用作 DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合染料（如 TOTO、YOYO、Stains All 等）。但生命科學(xué)研究中受歡迎的花青染料是由卡內(nèi)基梅隆大學(xué)的 Alan Wagoner 及其同事于 20 世紀(jì) 90 年代初推出的。這些染料是花青染料吲哚青綠 (ICG) 的改良版，自 20 世紀(jì) 70 年代起用于血管造影，它們都含有兩個位于聚次甲基鏈側(cè)的假吲哚環(huán)。人們發(fā)現(xiàn)這些染料與生物分子表現(xiàn)出低非特異性結(jié)合，并且由于其巨大的消光系數(shù)和良好的量子產(chǎn)率而具有明亮的熒光。可以從 Lumiprobe 購買，用于研究和商業(yè)用途，作為各種反應(yīng)性衍生物，例如用于點(diǎn)擊化學(xué)的NHS 酯、馬來酰亞胺、疊氮化物以及其他衍生物。

花青染料有兩種：非磺化花青和磺化花青。對于許多應(yīng)用來說，它們是可以互換的，因?yàn)樗鼈兊墓庾V特性幾乎相同。磺化和非磺化染料均可用于標(biāo)記 DNA 和蛋白質(zhì)等生物分子。染料之間的區(qū)別在于它們的溶解度：磺基染料是水溶性的，并且它們在水性環(huán)境中標(biāo)記時不使用有機(jī)共溶劑。它們在水中不易聚集。在某些情況下，需要其中一種類型的花青（請參閱下面的“磺化花青與非磺化花青"部分）。

非磺化花青

可用的非磺化染料包括 Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7 和 Cy7.5。 Cy ®代表“花青"，第一個數(shù)字表示假吲哚基團(tuán)之間的碳原子數(shù)。 Cy2 是一種惡唑衍生物，而不是吲哚寧，是該規(guī)則的一個例外。苯并稠合花青添加后綴 0.5。結(jié)構(gòu)的變化可以改變分子的熒光特性，并用多個熒光團(tuán)覆蓋可見光和近紅外光譜的最重要部分。

大多數(shù)非磺化花青衍生物（酰肼和胺的鹽酸鹽除外）的水溶性較低。當(dāng)這些分子用于生物分子標(biāo)記時，必須使用有機(jī)共溶劑（5-20％的DMF或DMSO）才能有效反應(yīng)。花青染料應(yīng)首先溶解在有機(jī)溶劑中，然后添加到生物分子（蛋白質(zhì)、肽、氨基標(biāo)記的 DNA）在適當(dāng)?shù)乃跃彌_液中的溶液中。當(dāng)綴合有效發(fā)生時，染料會在沉淀之前發(fā)生反應(yīng)。

非磺化花青的熒光性質(zhì)對溶劑和周圍環(huán)境的依賴性很小。非磺化花青染料的吸光度和熒光光譜繪制如下。

磺化花青

磺化花青包含額外的磺基，其有利于染料分子在水相中的溶解。帶電荷的磺酸基團(tuán)減少染料分子和重度標(biāo)記的綴合物的聚集。

目前可用的磺化花青包括磺基-Cy3、磺基-Cy5和磺基-Cy7。

磺化花青具有高度水溶性。使用這些試劑進(jìn)行標(biāo)記不需要有機(jī)共溶劑。

磺化花青與非磺化花青

磺化和非磺化花青表現(xiàn)出非常相似的熒光特性。然而，標(biāo)簽協(xié)議存在一些值得注意的差異。非磺化花青在使用前必須溶解在有機(jī)共溶劑（DMF 或 DMSO）中，并添加到目標(biāo)分子在水性緩沖液中的溶液中。對于 Cy3、Cy5、Cy7，建議的共溶劑體積應(yīng)為 10%，對于 0.5 對應(yīng)物，建議的共溶劑體積應(yīng)為 15%。磺基花青試劑可在純水溶液條件下使用。純化方面也存在差異：當(dāng)使用水或水性緩沖液透析進(jìn)行純化時，必須使用磺基花青以實(shí)現(xiàn)有效去除未反應(yīng)的染料物質(zhì)。磺基和非磺基花青的反應(yīng)可以通過凝膠過濾、色譜法（HPLC、FPLC、離子交換）或電泳進(jìn)行純化。

磺化和非磺化花青可互換用于標(biāo)記許多類別的目標(biāo)，包括：

• 可溶性蛋白質(zhì)，可耐受有機(jī)共溶劑的添加

• 抗體（使用 5-10% DMSO/DMF）

• DNA和寡核苷酸

• 肽

• 許多小分子

使用相似的磺化和非磺化試劑（例如磺基-Cy5 和 Cy5）產(chǎn)生的綴合物的熒光特性非常相似，并且可以與各種熒光儀器一起使用。

磺化花青必須用于：

• 被 DMF 或 DMSO 變性的敏感蛋白

• 通過透析純化時的蛋白質(zhì)綴合

• 水溶液中的納米顆粒

• 不溶性或疏水性蛋白質(zhì)

非磺化花青必須用于：

• 有機(jī)介質(zhì)（二氯甲烷、乙腈）中的反應(yīng)

  
  

  
  

  Lumiprobe 提供以下花青產(chǎn)品。

• Fluorophore	Reactive form
  sulfo-Cy3	NHS ester maleimide azide alkyne carboxylic acid
  sulfo-Cy5	NHS ester maleimide azide alkyne carboxylic acid
  sulfo-Cy7	NHS ester azide amine carboxylic acid
  Cy3	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy3.5	NHS ester azide carboxylic acid
  Cy5	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy5.5	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy7	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid
  Cy7.5	NHS ester maleimide azide alkyne hydrazide amine carboxylic acid